體內定時炸彈的引線——lncRNA H19與腹主動脈瘤
欄目:最新研究動態 發布時間:2019-05-31
腹主動脈瘤是一種腹部主動脈異常擴大的病變,宛如深藏體內的“定時炸彈”,這枚埋在體內的“定時炸彈”的危險性使得它逐漸得到重視……

腹主動脈瘤(AAA)是一種腹部主動脈異常擴大的病變,其發病隱秘,致死率高,破裂后如不經救治,24小時生存率小于50%,而總死亡率則高達85%95%,宛如深藏體內的“定時炸彈”。這枚埋在體內的定時炸彈的危險性使得它逐漸得到重視,許多學者將如何治療它當做一個值得攻克的難題,尋找誘發其發展因素。                                                                        

    今年4月,Dr. Yili Sun等人在雜志《Journal of Molecular and Cellular Cardiology》上發表了一篇名為“LncRNA H19 promotes vascular inflammation and abdominal aortic aneurysm formation by functioning as a competing endogenous RNA”的文章,文章介紹了LncRNA H19 如何促進血管炎癥進而誘導腹主動脈瘤形成的,為治療AAA提供了一個新的研究方向。

   背景:腹主動脈瘤(AAA)被認為是一種慢性血管炎癥性疾病。然而,在整個腹主動脈瘤形成的過程中,炎癥反應是如何被調控的尚不完全清楚。

    結果:qRT-PCR檢測到H19在人類與小鼠組織樣本中的表達上調。H19和巨噬細胞標識物MAC-2的共染色顯示H19位于血管平滑肌細胞(VSMCs)和浸潤的主動脈巨噬細胞中。H19在體內的過表達增強了血管炎癥并誘導AAA形成,其支持因素有主動脈形態惡化,主動脈最大直徑值、彈性蛋白降解、白細胞介素-6 (IL-6)和巨噬細胞趨化蛋白-1 (MCP-1)表達以及巨噬細胞浸潤。 H19抑制表現出了相反的效果。解救實驗表明,IL-6中和作用能顯著緩和因H19過表達誘發的主動脈炎癥和AAA的形成。熒光素酶報告分析和體外實驗利用VSMCs和巨噬細胞證明,H19let-7a microRNA內源性競爭誘導其靶基因IL-6的轉錄,在一定程度上誘導動脈瘤形成。這個機制通過利用不能與let-7a有效結合的突變體H19的體內實驗進一步證實。

   結論:本研究揭示了AAA形成過程中一條致病性H19/let-7a/IL-6炎癥通路,并為AAA的治療提供了一種潛在的新策略。
         研究結果:


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                                                                                                Figure 1.H19在人類主動脈瘤樣品和Ang II-、CaC12-誘導的小鼠主動脈中再表達

AC,人主動脈IL-6(A),MCP-1(B)和H19(C)表達水平的qPCR結果(n=5)。連續28天給雄性ApoE-/-小鼠灌注Ang II (1μg/kg/min)或等量生理鹽水。D,小鼠主動脈H19表達的qRT-PCR分析(n=5)。E,在主動脈連續樣本片段中,H19的原位雜交復合染色和巨噬細胞的免疫熒光染色(MAC-2)(n=5)。雄性C57BL/6J小鼠腎主動脈上用CaCl2紗布或生理鹽水紗布處理15分鐘。3周后進行檢測。F,小鼠主動脈H19水平的qRT-PCR結果(n=5)。G,H19的原位雜交復合染色和巨噬細胞的免疫熒光染色(MAC-2) (n=5)。數據以三次獨立實驗的平均值±SD表示,**P<0.01.

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                                                                               Figure 2.在Ang II-治療的 ApoE-/- 小鼠中,H19的減少阻止了AAA的形成
用Scr-RNA或Sh-H19轉染雄性ApoE-/-小鼠(每組25只)。三十天后,再連續28天注入Ang II。生理鹽水,連續28天給雄性ApoE-/-小鼠灌胃與生理鹽水等量的假生理水(每組10例)。A,主動脈宏觀特征的代表圖像。B,主動脈的二維超聲和彩色多普勒成像。C,AAA發生率的統計學分析(每組25例)。D,腹主動脈最大直徑(每組16例)。E,主動脈中代表性的彈性蛋白染色和彈性蛋白降解評分。照片顯示了彈性蛋白降解最嚴重的位置(每組n=15;比例尺:上200μm下50μm;放大的照片)。F,主動脈MAC-2免疫熒光染色具有代表性(每組4例;比例尺:上200μm下50μm;放大的照片)。數據表示為平均值±SD或中位數和IQR(彈性蛋白降解評分)。 *P<0.05, **P<0.01

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                                                                                                     Figure 3.在Ang II治療的C57BL/6J小鼠中H19過表達誘導AAA形成

雄性C57BL/6J小鼠分別轉染AAV-GFP或AAV-GFP- h19(每組25只)。30天后,再連續28天注入Ang II。生理鹽水,連續28天給雄性C57BL/6J小鼠灌胃與生理鹽水等量的假生理水(每組10例)。A,主動脈宏觀特征的代表性圖像。B,主動脈二維超聲及彩色多普勒成像。 C,小鼠AAA發病率的統計分析(每組N=25)。D,腹主動脈最大直徑(每組16個)。E,主動脈彈性蛋白染色及彈性蛋白降解評分具有代表性(每組n=15)。照片顯示的位置發生最嚴重的彈性蛋白降解(比例尺:上200μm下50μm;放大的照片)。F,主動脈MAC-2蛋白表達的代表性免疫熒光染色及統計學分析(n=4;比例尺:上200μm下50μm;放大的照片)。 數據表示為平均值±SD或中位數和IQR(彈性蛋白降解評分)。*P<0.05,**P<0.01。

 

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                                               Figure 4. H19過表達促進CaCl2-治療的C57BL/6J小鼠體內AAA的形成

雄性C57BL/6J小鼠在用CaCl2紗布處理腎上主動脈前30天,分別注射病毒載體AAV-GFP- h19或AAV-GFP(每組n=25)。生理鹽水,用等量生理鹽水處理假生理鹽水注射的雄性C57BL/6J小鼠(n=10)。CaCl2治療3周后進行檢測。A,AAA的代表性圖片。B,腹主動脈的最大動脈直徑(每組n=10)。 C,病毒注射后主動脈H19 RNA水平的統計分析(每組n=4)。 D,小鼠主動脈彈性蛋白染色及降解評分具有代表性。照片顯示了彈性蛋白降解最嚴重的地方(每組n=10;比例尺:上 200 μm,下50 μm; 放大的圖片)。E,主動脈MAC-2蛋白表達的代表性免疫熒光染色及統計學分析(每組n=4,比例尺:上200 μm,下50 μm;放大的圖片)。數據表示為平均值±SD或中位數和IQR(彈性蛋白降解評分)。**P<0.01。

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                                                                             Figure 5. H19在VSMCs中起著let-7a海綿的作用
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,H19與let-7a、IL-6與let-7a之間的潛在結合位點以及構建的突變體結合位點。B,熒光素酶報告基因檢測結果。用功能性let-7a mimics或無效let-7a 類似物 (mimicNC)瞬時轉染VSMCs。24h后,用含有野生型IL-6 (IL-6- WT)或突變型IL-6 (IL-6- MUT)的熒光素酶報告轉染。24h后檢測熒光素酶活性。 C,雙熒光素酶報告基因檢測結果。用功能性let-7a模擬物(let-7a mimics)或無效的let-7a模擬物(mimicNC) 瞬時轉染VSMCs,然后用含有野生型(H19- WT)或突變體H19 (H19- MUT1, H19-MUT2)的熒光素酶報告轉染。24h后檢測熒光素酶活性。D,雙熒光素酶報告基因檢測結果。 瞬時轉染功能質粒介導的H19轉錄本(pcDNA3.1-H19)或假轉錄本(pcDNA3.1-NC),選擇性加入功能let-7a模擬物。之后,用含有野生型IL-6 (IL-6- WT)或突變型IL-6 (IL-6- MUT)的熒光素酶報告基因轉染細胞。24h后檢測熒光素酶活性。**P<0.01。實驗四重復。

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                                                                                                   Figure 6.主動脈H19靶向并負向調節let-7a促進IL-6在VSMCs的表達

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                                            Figure 7.較高的let-7a生物活性可延緩Ang II-治療的C57BL/6J小鼠體內AAA的形成

雄性C57BL/6J小鼠轉染AAV-H19或AAV-H19-mut(每組n=26)。30天后,他們又被注入Ang II,持續28天。A,主動脈宏觀特征的代表性圖像。B,腹主動脈最大直徑(每組n=14)。C,AAA發生率統計分析(每組n=26)。D and E,主動脈中代表性彈性蛋白染色(D)和彈性降解分數(E)。照片顯示了彈性蛋白降解最嚴重的地方(每組n=14;比例尺:上200 μm,下50 μm;放大的照片)。 F and G,主動脈MAC-2代表性免疫熒光染色(F)及其統計分析(G)(每組n=4;比例尺:上200 μm,下50 μm;放大的照片)。 H,血漿IL-6濃度(每組n=8)。數據表示為平均值±SD或中位數和IQR(彈性蛋白降解評分)。*P<0.05, **P<0.01。

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                                                                               Figure 8. 證實IL-6在h19促進AAA形成過程中的炎癥中介作用

用AAV-H19轉染雄性C57BL/6J小鼠。30天后,隨機給予托珠單抗(TCZ,一種針對IL-6受體的單克隆抗體)或等量的IgG(每組n=30)治療。治療24小時后,所有小鼠再灌注Ang II 28天,然后處死進行檢查。A,兩組宏觀主動脈代表圖像。B,腹主動脈最大直徑(每組n=14)。C, AAA發生率統計分析(每組n=30)。DE,主動脈中代表性彈性蛋白染色(D)和彈性降解分數(E)。照片顯示了彈性蛋白降解最嚴重的地方(每組n=14;比例尺:上200 μm,下50 μm;放大的照片)。FG,主動脈MAC-2代表性免疫熒光染色(F)及其統計分析(G)(每組n= 5;比例尺:上200 μm,下50 μm;放大的照片)。 數據以均數±標準差表示。*P<0.05,**P<0.01。


 

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